5-Aminofluorescéine

La 5-Aminofluorescéine (également appelée 5‑AF ou Fluorescéinamine) est largement utilisée comme réactif de marquage fluorescent. L'amine primaire de la 5-aminofluorescéine peut réagir avec des groupes carboxyle (via l'activation EDC/NHS), des aldéhydes, des cétones ou des esters activés (par exemple, les esters NHS) pour former des liaisons amide ou imine stables. Il présente un maximum d'excitation à ~ 490 nm (λmax = 496 nm dans un tampon borate pH 8,5) et un maximum d'émission à ~ 515 nm, délivrant un signal vert vif avec une bonne photostabilité et un décalage de Stokes d'environ 40 nm. Son intensité de fluorescence dépend du pH, augmentant notamment dans des conditions alcalines (pH 8-9), ce qui est attribué aux changements dans l'état de protonation du groupe amino.

La 5-aminofluorescéine a trouvé une large utilisation dans la recherche biologique et médicale – du marquage des protéines et des anticorps à la construction de systèmes d’administration de médicaments ciblés et de capteurs fluorescents. La 5-aminofluorescéine est également un intermédiaire clé dans la synthèse de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC Isomer I), l'un des réactifs les plus populaires pour le marquage des protéines.

Paramètres du produit

Notes de préparation et de stockage

Le 5‑AF est généralement synthétisé à partir de l'acide 4‑nitrophthalique, suivi d'une réduction (par exemple avec de l'hydrazine/FeOOH) et d'une condensation avec du résorcinol dans de l'acide méthanesulfonique. Le produit brut est un mélange d’isomères 5 et 6, séparés par cristallisation. Les méthodes modernes (assistées par micro-ondes ou enzymatiques) peuvent améliorer le rendement et réduire les sous-produits. La purification finale par HPLC garantit une pureté ≥95 %, avec une structure confirmée par RMN et MS.

Stockage – Le composé est sensible à la lumière, à l’air et à l’humidité. Conserver dans un récipient scellé purgé à l'argon à 4 °C dans l'obscurité. Pour un stockage de longue durée (>6 mois), -20°C sous forme de poudre est recommandé (stable pendant au moins 3 ans). Les solutions dans le DMSO peuvent être conservées à -80°C pendant 6 mois ou à -20°C pendant 1 mois. Évitez les cycles de gel-dégel répétés. Le transport à température ambiante est acceptable à condition de le protéger de la lumière et de l’humidité.

Foire aux questions (FAQ)

Q1 : Quelle est la différence entre la 5‑Aminofluorescéine (5‑AF) et le FITC ? Comment choisir ?

R : Les deux sont des colorants fluorescents verts, mais leurs groupes réactifs diffèrent.

● Le 5‑AF possède une amine primaire (–NH₂). Cela nécessite l’activation du groupe carboxyle d’une cible (en utilisant EDC/NHS) avant la conjugaison. Idéal pour marquer les molécules qui contiennent déjà un groupe carboxyle.

● FITC possède un groupe isothiocyanate (–N=C=S) qui réagit directement avec les amines sur la cible (par exemple, les résidus lysine dans les protéines) – aucune activation préalable n'est nécessaire. FITC est plus pratique pour le marquage de routine des protéines.

● Choisissez 5‑AF si vous avez besoin d'une conjugaison spécifique et orientée (par exemple, via une poignée carboxyle) ou si vous envisagez de synthétiser des dérivés fluorescents personnalisés. FITC est généralement plus simple pour le marquage direct des anticorps.

Q2 : Quelles sont les conditions de réaction typiques pour le marquage de biomolécules avec du 5‑AF ?

R : La méthode la plus courante est le couplage amide : activez les groupes carboxyle sur la molécule cible avec EDC et NHS (dans un tampon MES ou PBS, pH 5,5–6,5), puis ajoutez du 5‑AF et ajustez à pH 7,5–8,5. Incuber à température ambiante ou à 37°C pendant 2 à 4 heures. Pour les cibles contenant des aldéhydes (par exemple, les glycoprotéines), utilisez une amination réductrice avec du cyanoborohydrure de sodium. Le colorant n'ayant pas réagi peut être éliminé par dessalage ou dialyse. Un rapport molaire colorant/protéine de 5:1 à 20:1 est un bon point de départ.

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