Les cascades biocatalytiques permettent la fabrication du peptide macrocyclique Enlicitide

L'inhibiteur oral expérimental de la PCSK9 de MSD, l'enlicitide décanoate (MK-0616), est le premier inhibiteur oral du peptide macrocyclique PCSK9 à démontrer une réduction substantielle du LDL-C chez l'homme. L'enlicitide a été développé à partir d'un écran d'affichage d'ARNm de peptides monocycliques, puis stabilisé par des liaisons croisées non peptidiques pour générer une structure comprenant trois macrocycles fusionnés. Cet octapeptide complexe contient six acides aminés non naturels et deux acides aminés protéinogènes reliés par 12 liaisons amide et un lieur de chaîne central à six carbones. La synthèse chimique traditionnelle nécessite 43 étapes, des manipulations de groupes protecteurs (près de la moitié des étapes de synthèse), des purifications chromatographiques et une étape de métathèse de fermeture de cycle catalysée par le ruthénium hautement dilué, ce qui limite l'évolutivité et la durabilité.

Développement de la fabrication chimioenzymatique

Les scientifiques de MSD ont développé un processus chimioenzymatique concis et convergent pour fabriquer du décanoate d'enlicitide (1), rendu possible par le couplage direct de monomères par des acides aminés ligases, combiné à une ligature biocatalytique de fragments peptidiques et à des macrocyclisations utilisant des estérases et des imines réductases.

Réalisations clés

Assemblage en cascade de trois enzymes utilisant des ligases ATP-grasp

- La cascade de trois enzymes (deux ligases ATP-grasp modifiées + recyclage de l'ATP) assemble un tétrapeptide à partir d'acides aminés non protégés. Les ligases ATP-grasp (en particulier les ligases d'acides aminés dépendant de l'ATP, AAL) sont des enzymes qui catalysent la formation de liaisons amide entre des acides aminés ou des peptides non protégés en utilisant l'ATP comme source d'énergie. Leur mécanisme passe par un intermédiaire anhydride mixte, qui permet un couplage direct sans avoir besoin de groupes protecteurs sur l'amine nucléophile ou de donneurs d'acyle activés. Dans cette étude, les chercheurs ont utilisé une ligase ATP-grasp de Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) et des variantes modifiées (Trp-BaAALEng et Phe-BaAALEng) pour étendre sélectivement un dipeptide avec deux acides aminés non naturels (analogues du tryptophane et de la phénylalanine) dans une cascade à un seul pot. Ces ligases ont une poche électrophile étroite et enterrée qui accepte des acides aminés uniques comme électrophiles (substrats C-terminaux) mais peut accueillir des peptides plus longs comme N-nucléophiles. Cette sélectivité les rend idéales pour l’assemblage séquentiel de peptides sans groupe protecteur, de l’extrémité C à l’extrémité N. L'ATP consommé est recyclé à l'aide d'une polyphosphate kinase (FbPPKWT) avec de l'hexamétaphosphate peu coûteux comme donneur de phosphate.

Macrolactamisation régiosélective de l'estérase artificielle (RsEstEng)

- L'estérase artificielle (RsEstEng) catalyse la macrolactamisation régiosélective pour former le fragment Northern (rendement 73 %, échelle de 52 kg). RsEstEng est dérivé d'une carboxylestérase de type sauvage (RsEst) identifiée à partir de Roseibacillus sp. Sa fonction native est l'hydrolyse des liaisons ester. Grâce à une évolution dirigée, les chercheurs l'ont converti en catalyseur de macrolactamisation régiosélective – la formation d'une liaison amide macrocyclique – dans la synthèse du fragment Northern (4) de l'enlicitide. Il accepte l'ester tert-butylique stable et volumineux du tétrapeptide linéaire (9) comme donneur d'acyle pour produire le peptide macrocyclique (4) afin de former une liaison amide intramoléculaire. Il a obtenu une cyclisation sélective sans oligomères détectables et avec seulement 0,8 % de sous-produit d'hydrolyse d'ester, même dans les conditions de force ionique élevée de la cascade enzymatique précédente.

Liaison intermoléculaire à la thioestérase artificielle (BlTEEng)

- La thioestérase artificielle (BlTEEng) réalise la ligature intermoléculaire des fragments Nord (4) et Est (3) sans épimérisation. BlTEEng est une version modifiée d'un domaine thioestérase (TE) initialement excisé de la peptide synthétase non ribosomique (NRPS) de Brevibacillus laterosporus (BlTE). Les thioestérases de type sauvage dans les systèmes NRPS catalysent généralement la macrocyclisation ou la libération de peptides linéaires à partir d'une protéine porteuse via une liaison thioester. Les variantes modifiées de BlTE ont montré une certaine activité mais ont favorisé les sous-produits dimères. L'ingénierie enzymatique a modifié l'enzyme pour catalyser la ligature intermoléculaire en utilisant des oxoesters d'isopropyle plus stables au lieu des thioesters naturels et hydrolytiquement labiles.

Macrocyclisation par amination réductrice en cascade à quatre enzymes

- La cascade de quatre enzymes (PsIREDEng, KsKREDEng et enzymes de recyclage des cofacteurs StLDHWT, TvADHWT) permet une macrocyclisation par amination réductrice pour former une diamine bicyclique (rendement de 69 %, échelle de 46 kg). KsKREDEng est une cétoréductase modifiée de Kyrpidia sp. Il catalyse l'oxydation d'un composé alcool benzylique (10) en un aldéhyde transitoire (11) dépendant du NAD+. PsIRED est une imine réductase de Pseudogymnoascus sp. Il est dépendant du NADPH. PsIREDEng catalyse l'amination réductrice de l'aldéhyde (11) et de l'amine existante pour former l'imine cyclique (12), suivie d'une réduction en macrocycle d'amine secondaire (13). StLDHWT régénère le NAD+ pour l'étape oxydative en réduisant le pyruvate en lactate, tandis que TvADHWT régénère le NADPH pour l'étape réductrice en oxydant l'isopropanol en acétone.

Macrocyclisation finale via la PBP thioestérase modifiée

- Le couplage chimique avec le fragment Western (2), suivi par la protéine thioestérase liant la pénicilline (SsPBP-TEEng), ferme le macrocycle final à une concentration élevée (70 g/L) – surmontant la limitation de dilution typique (5 g/L en synthèse traditionnelle). Le processus global comprend trois étapes en cascade, 7 enzymes artificielles + 3 enzymes auxiliaires, un rendement global de 39 %, une démonstration à l'échelle de plusieurs kilogrammes, une pureté >99 %, pas de chromatographie et aucun groupe protecteur. Ce travail fournit un modèle durable et évolutif pour la fabrication de peptides macrocycliques complexes, réduisant considérablement le nombre d'étapes et le gaspillage tout en améliorant l'efficacité et l'accès aux patients.