01 Contexte et défis de la R&D
1.1 Le contexte du développement du médicament MK-0616
Enlicitide Decanoate (également connu sous le nom de MK-0616) est le premier inhibiteur oral du peptide macrocyclique PCSK9 entièrement conçu de novo, destiné à réduire le cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL-C) et à traiter les maladies cardiovasculaires athéroscléreuses.
Comme le montre la figure ci-dessus, outre le MK-0616, des exemples classiques dans ce domaine incluent également l'antibiotique vancomycine (2), l'agent chimiothérapeutique paclitaxel (3) et l'éribuline, un médicament anticancéreux (4). Les structures complexes des composés 2 et 3 font que leur synthèse proprement dite repose toujours sur des méthodes semi-synthétiques à base de produits naturels ; en revanche, l’équipe Eisai a réalisé la synthèse totale du composé 4 en plus de 60 étapes, marquant une étape importante dans la synthèse des composés polycétides.
Concernant le MK-0616, sa structure chimique est tout à fait unique : c'est la première molécule entièrement conçue de toutes pièces (plutôt que dérivée de sources naturelles) ; de plus, en tant qu’inhibiteur oral quotidien de PCSK9 destiné au traitement des maladies cardiovasculaires plutôt qu’à des applications oncologiques ou anti-infectieuses, sa demande mondiale dépassera de loin celle des médicaments innovants conventionnels, nécessitant une production à une échelle allant de centaines de kilogrammes à plusieurs tonnes.
1.2 Défis et stratégies synthétiques
La complexité moléculaire du MK-0616 impose des exigences strictes en matière de développement de processus.
Caractéristiques structurelles : Bien que MK-0616 provienne d'un peptide macrocyclique identifié grâce au criblage de la technologie d'affichage d'ARNm, il contient 6 acides aminés non canoniques (totalisant 8 unités d'acides aminés), un macrocycle à 37 chaînons, une chaîne latérale de sel d'ammonium (10) et un fragment non peptidique (13), rendant les techniques conventionnelles de synthèse peptidique en phase solide complètement inefficaces, comme illustré ci-dessous.
Les principaux défis à relever
1、La stabilité des intermédiaires polaires (notamment pour les fragments de sels d'ammonium, où le contre-ion doit être contrôlé tout au long du procédé)；
2、La sélectivité de la fermeture des grands anneaux (nécessite une optimisation de la séquence d'assemblage parmi 10 blocs)；
3、Défis de mise à l’échelle (éviter la purification chromatographique ; assurer un débit à l’échelle du milligramme au kilogramme)；
Donc, la décision clé proposée par les chercheurs est la suivante：
1、diviser pour régner：Donner la priorité à la construction du « fragment Nord » (un cycle à 17 chaînons composé d’acides aminés non canoniques aux positions 5, 6 et 7) et simplifier la stratégie de clivage macrocyclique grâce à une analyse rétrosynthétique (par exemple, en sélectionnant la liaison amide entre les positions 5 et 8).
2、Introduction de la chaîne latérale du terminal：Le fragment de sel d'ammonium polaire (10) doit être réservé à l'étape d'installation finale afin d'éviter les problèmes associés à la purification intermédiaire.
3、L’application flexible de l’acide–réactions de neutralisation des bases (RCM)：Une chaîne liée au n-hexane est formée aux positions 7–13 ; cette réaction présente une excellente orthogonalité et peut être réalisée en plusieurs étapes.
Grâce à cette série de stratégies, les chercheurs ont finalement établi une voie de synthèse évolutive, ouvrant la voie à l’évaluation clinique.02
02 Stratégie synthétique et optimisation
Grâce à des études analytiques, les chercheurs ont réalisé une optimisation en plusieurs étapes et plusieurs générations du fragment macrocyclique clé (fragment Nord) et ont optimisé l’assemblage du fragment Sud avec le produit final.
2.1 Optimisation multigénérationnelle du segment Nord :
Première génération– 37 itérations
La synthèse d'acides aminés non canoniques (par exemple, la 3-hydroxyproline) présente une faible efficacité, car elle repose sur des réactions de cyclisation inefficaces.—comme la condensation de Dieckmann—ainsi que la résolution chirale ; de plus, ce processus nécessite plusieurs cycles de manipulation du groupe protecteur et plusieurs purifications chromatographiques, comme illustré dans la figure ci-dessous.
Tous ces facteurs limitent la synthèse à grande échelle de fragments cibles.
Système synchrone de deuxième génération
Une avancée majeure a été réalisée grâce à la biocatalyse : l'introduction de la réduction des cétones (KRED) a permis une réduction hautement efficace et stéréosélective desβ-les hydroxyesters ; de plus, l’enzyme TrpB modifiée a été utilisée pour synthétiser du tryptophane fluoré, éliminant ainsi le besoin de résolution chirale. En conséquence, le nombre d’étapes de synthèse a été réduit et l’utilisation de groupes protecteurs a été minimisée, comme l’illustre la figure ci-dessous.
Cette voie de synthèse pour l’optimisation du fragment Northern a également été appliquée en développement clinique ; cependant, les opportunités découlant de la stratégie structurelle ont créé un besoin d’optimisation supplémentaire de la voie de synthèse des fragments.
Premièrement, les principales conclusions concernant les trois intermédiaires de cristallisation au stade avancé constituent un point critique pour le contrôle de la pureté ; il est donc essentiel de modifier la voie de synthèse pour intercepter ces trois intermédiaires.
Deuxièmement, il est recommandé d'effectuer la réaction de cyclotrimérisation des oléfines le plus tard possible au cours du processus de synthèse. Cette approche repose sur la considération selon laquelle les catalyseurs au ruthénium peuvent augmenter le coût global de la production de benzothiuramine ; réaliser cette réaction au stade final de la voie de synthèse peut ainsi réduire considérablement les coûts.
Cela a donc facilité l’optimisation de l’approche de troisième génération.
Système pas à pas commun de troisième génération
Par hydroxylation enzymatique, la L-proline est directement oxydée en 3-hydroxyproline avec une stéréosélectivité supérieure à 99 : 1 ; des intermédiaires clés ont été identifiés, tels que la cristallinité du sel de benzènesulfonate, qui a permis d'éviter une purification chromatographique ; un assemblage modulaire a été utilisé, ainsi que des ajustements de la séquence de couplage des acides aminés et une simplification de la stratégie du groupe protecteur, comme illustré dans la figure ci-dessous.
Le fragment synthétique MK-0616 Northern de troisième génération diffère des fragments synthétisés au cours des deux générations précédentes. Cette sélection a été motivée par l'identification du pentanoate cristallin 91, dépourvu du résidu d'acide aminé thréonine (qui sera incorporé plus tard lors de la synthèse). Ce sel peut être isolé avec un rendement et une pureté élevés et fournit un intermédiaire hautement stable qui peut être stocké comme intermédiaire clé tout au long du processus de synthèse.
Grâce à l'optimisation de la troisième génération, la séparation du fragment Nord (91) nouvellement conçu ne nécessite désormais que 14 étapes—seulement un tiers du nombre d’étapes requises pour la synthèse de première génération. De plus, il est important de noter que dans le protocole de troisième génération, la séquence linéaire la plus longue a été réduite de plus de moitié, passant de 20 étapes à 9 étapes.
2.2 Optimisation du fragment Sud
Première génération, comprenant 15 marches
Partant de matières premières achetées en grande quantité auprès de fournisseurs commerciaux, le processus en 9 étapes représente la séquence linéaire la plus longue, comme le montre la figure ci-dessous.
Système synchrone de deuxième génération
Dans la synthèse de deuxième génération, ce qui a été amélioré n’est pas le nombre d’étapes, mais plutôt l’efficacité globale et le contrôle de la pureté, comme l’illustre le schéma ci-dessous. Après des milliers d'essais, un fragment de Southern blot appelé sel de leelamine (99) a été identifié.
Il a déjà été démontré que l'utilisation de ces deux composés servait de solvants non chiraux pour les acides carboxyliques ; par conséquent, le sel cristallin (99) peut être obtenu de manière surprenante sous la forme d'une substance hautement pure, évitant ainsi le travail HPLC préparatoire approfondi requis dans la génération précédente de synthèse.
2.3 Assemblage du produit final
Le fragment Nord de première génération et le deuxième intermédiaire du fragment Sud peuvent être facilement protégés pour produire le précurseur linéaire 61, comme le montre la figure ci-dessous ; cependant, le rendement en produit de métathèse de cyclooléfine est très faible.
Quoi qu’il en soit, les chercheurs ont utilisé avec succès une autre séquence, permettant ainsi la première synthèse évolutive du MK-0616, comme illustré dans le schéma ci-dessous.
Les sels d'énaldéhyde de première génération ont été synthétisés via un processus en 63 étapes qui commence par l'installation de chaînes latérales sur le noyau moléculaire par une amidation à haut rendement suivie d'une purification par SFC ; parmi ces étapes, l'étape 28 représente la séquence linéaire la plus longue.
La combinaison de produits finaux de deuxième génération est présentée dans la figure ci-dessous.
En optimisant les voies des fragments du Nord et du Sud ciblant le produit cible, les deux approches peuvent utiliser des intermédiaires cristallins à fragments plats pour passer à l’étape finale de la synthèse.
Cette réaction de couplage est suffisamment propre pour passer directement à l'étape suivante utilisant une réaction brute.
Au total, la voie de synthèse de deuxième génération pour MK-0616 nécessite 43 étapes, parmi lesquelles 21 étapes constituent la séquence linéaire la plus longue. Cette séquence réduit d’un tiers à la fois le nombre total d’étapes et la longueur de la séquence linéaire la plus longue par rapport au processus de première génération.
03 Innovation technologique clé
Une analyse de l'ensemble du processus d'optimisation révèle plusieurs innovations dans des technologies clés, telles que :
1、Technologie de biocatalyse :Résolution cinétique dynamique KRED ; Synthèse médiée par l'enzyme TrpB d'analogues du tryptophane ; introduction directe de groupes hydroxyle via la proline hydroxylase ; etc.
2. Purification basée sur la cristallisation: Plusieurs étapes intermédiaires—comme le méthylsulfonate de fragments de Northern blot ou le sel de leelamine de fragments de Southern blot—sont utilisés pour réaliser une purification par cristallisation, éliminant ainsi le besoin de colonnes de chromatographie.
3. Stratégie de groupe protecteur orthogonal: commutation flexible entre les groupes protecteurs tels que Boc et Nosyl pour assurer la sélectivité des réactions en plusieurs étapes.
4. Considérations sur la chimie verte: réduire l'utilisation de catalyseurs de métaux lourds (par exemple, les catalyseurs au ruthénium) et déplacer la réaction RCM à un stade ultérieur afin de réduire les coûts de production.
04 Résumé et perspectives
Cet article démontre une intégration flexible de la biocatalyse et de la synthèse chimique, tout en mettant l'accent sur le rôle central des processus de cristallisation et en adoptant une approche de conception modulaire, présentant ainsi une méthodologie systématique allant de l'exploration en laboratoire à la production à l'échelle industrielle. Ce travail représente un cas exemplaire dans le domaine de la synthèse moléculaire complexe : le nombre total d’étapes a été réduit de 63 dans le protocole de première génération à 43 dans le protocole de deuxième génération, avec des rendements augmentés de près de 1 000 fois et permettant la faisabilité d’une production à l’échelle d’une tonne. Tout au long du processus, un accent stratégique est mis sur l'étape de cristallisation, évitant ainsi la purification chromatographique, une caractéristique qui la rend parfaitement adaptée à la production à l'échelle de la tonne. En outre, cette étude fournit un modèle technique pour les approches synthétiques d’autres peptides macrocycliques complexes.
